Nature：额外的X染色体如何损害男性胎儿生殖细胞的发育？

       通常，女性通过X染色体失活来降低X连锁基因的剂量。但是在女性胎儿生殖细胞（FGC）发育过程中X染色体会被重新激活，且X连锁基因的剂量对于FGC发育至关重要。那么，X连锁基因的剂量如果异常会如何损害人类FGC的发育呢？2024年10月30日，北京大学第三医院乔杰/袁鹏/闫丽盈/魏瑗团队合作在Nature上发表了题为How the extra X chromosome impairs the development of male fetal germ cells的研究论文。该研究以具有额外X染色体的Klinefelter综合征（Klinefelter syndrome，KS）FGC为天然研究模型，揭示了额外X染色体的活性状态、转录特征、表观修饰特征，并探究了KS患者生殖细胞的发育特征和相关分子改变。

       Klinefelter综合征，也称为先天性曲细精管发育不全综合征，是一种影响男性生育和其他健康问题的性染色体异常遗传病，染色体组成是47，XXY，在男性中发病率约1/600，占无精子症病例的10-12%。KS 患者在青春期前会经历大量生殖细胞丢失，但其潜在机制仍不清楚。先前的研究表明女性FGC中X连锁基因的剂量比男性生殖细胞高约1.6倍[1]，且正常男性生殖细胞中X连锁基因与常染色体基因的表达比值低于1，也低于其周围体细胞中的表达比值[2]，这意味着男性FGC的发育需要相对低剂量的X连锁基因。由此可见，额外的X染色体所致X连锁基因剂量的异常可能是导致KS患者FGC发育异常的重要原因。

1. KS胎儿性腺FGC发育迟缓

       这项研究选用KS胎儿、男性和女性对照胎儿性腺为研究对象，利用包括单细胞转录组、空间组和DNA甲基化等多组学技术，解析了胎儿性腺中生殖细胞和体细胞的发育特征和分子改变（图1a）。研究人员首先利用Smart-seq2技术获得了KS胎儿和男性对照胎儿的性腺细胞转录组数据，根据已知的分子标志物，鉴定出5种细胞类型：早期FGC（标志物为POU5F1），晚期FGC（标志物为DDX4），Leydig 前体细胞（LP），分化的 Leydig 细胞（DLC）和 支持细胞（SC）（图1b）。进一步分析发现，相比于男性对照，KS胎位的FGC更多处于早期阶段（图1c）。为了验证这一发现，研究者用免疫荧光对早期和晚期FGC的标志物进行染色，证实KS患者性腺中早期FGC的比例显著高于男性对照（图1d-e），同时两组的FGC总数无显著差异。由此表明，妊娠中期患有KS的胎儿中没有明显的生殖细胞丢失，而是表现为FGC的发育迟缓。

图1 KS胎儿FGC发育迟缓

2. KS胎儿 FGC 中的基因调控失常

       研究人员对KS胎儿的早期FGC和晚期FGC的转录谱进行分析（对照为男性对照），早期FGCs中鉴定出324个上调和 253个下调的差异表达基因 （DEG）。上调基因富集于组蛋白修饰、干细胞种群维持、经典 WNT 通路、TGF-β通路和去甲基化，而下调基因富集在piwi相互作用RNA （piRNA） 代谢过程和减数分裂细胞周期过程。其中，在维持FGC的初始状态中起重要作用的WNT通路和TGF-β通路（尤其是NODAL信号通路）[3]显著上调（图2f）。基于全局转录谱的分析表明，与对照男性相比，KS 早期FGCs中NODAL信号传导、多能性和迁移的得分较高，晚期FGC的得分较低，且在晚期FGCs中也表现出类似的基因表达模式（图2g）。piRNA代谢和减数分裂基因是FGC分化的特征，其中DAZL等特定基因通过下调多能基因和上调晚期FGC基因来促进FGC分化[4]，本研究结果中也发现DAZL在KS中有较低表达（图2h-i）。

图2 KS患者早期FGCs中的基因失调

       研究人员在KS胎儿的晚期FGC中鉴定出136个上调的 DEGs和138个下调的DEGs。与进入有丝分裂停滞期的正常晚期FGC相比，KS胎儿的晚期FGC上调DEGs富集在DNA复制的基因、DNA 构象变化和染色体分离的更高表达（图3h）。表明KS晚期FGCs没有完全发育到有丝分裂停滞期。与此一致，在KS晚期 FGC中，FGC迁移的标志物IFITM1和早期FGC标志物NANOS3 、以及ATP合成耦合电子传递相关的基因（如NDUFB11、COX8A 和 NDUFA3）均出现显著上调（图3i,k-n）。此外，在KS晚期FGC中， 一些对FGC向精原细胞过渡很重要的基因（例如，PIWIL4 和 METTL5)表达降低，这可能损害了它们进一步分化为精原细胞（图3j）。上述发现表明 KS胎儿FGC发育晚期无法完全进展到有丝分裂停滞期，仍处于幼稚期状态。

图3 KS患者晚期FGCs中的基因失调

3. 额外的X染色体对KS FGCs转录失调与发育迟缓的影响

       为了确定KS患者中X染色体的状态和转录特征，研究人员先进行了等位基因表达分析，结果显示KS早期FGC和晚期 FGC中X染色体的双等位基因比值与常染色体相当，而在体细胞中则显著降低（图4a）。免疫荧光染色进一步证实，具有X 染色体失活功能的H3K27me3仅出现在KS胎儿性腺的体细胞中，而没有出现在FGC中（图4b）。这些结果表明在KS的FGC中，两条 X 染色体一直具有转录活性。

       随后，研究人员利用RNA、DNA 和蛋白质的三重原位荧光（TISF）检测研究 X染色体失活（XCI）相关分子的空间表达。XIST 是一种在体细胞中启动 XCI 的长链非编码RNA，若XIST和H3K27me3共定位于体细胞中的一条X染色体上，则表明该X 染色体被灭活。根据相对于周围体细胞的分散性、荧光面积和平均荧光强度（MFI），研究人员将FGCs中的XIST信号分为无XIST（NO XIST）、分散云（Dispersed cloud）、受限云（Confined cloud）和星云（Nebular cloud）四种模式，这四种模式分别代表XIST的表达水平依次增加的状态（图 4c）。研究人员选择女性胚胎性腺作为对照（男性不存在X染色体失活），发现对照与KS的FGC中XIST信号都会随FGC的分化发育下调，但是针对发育各个时期进行组间比较，结果显示KS FGC中XIST的信号均高于对照组（图4d）。

       此外，研究人员比较了男性对照、女性对照和KS FGC中X连锁基因的表达剂量。KS早期FGC和晚期FGCs中X连锁基因的剂量分别比男性对照高1.68倍和1.59倍（图4f）；KS早期和晚期FGCs 中X连锁基因的剂量比女性对照高1.01倍和1.05 倍。因此，研究人员推断X连锁基因的过量表达会阻碍KS FGC的分化。KS FGC中上调的差异基因也表现出了显著的X 连锁基因富集（早期FGCs为22.2%，晚期FGCs为42.6%）（图4g）。研究人员根据X 连锁基因在体细胞中的XCI状态分为四组，包括失活、逃逸、可变逃逸和未知，KS FGCs中上调的X连锁DEGs主要为逃逸基因和失活基因（图4h）。此外，X连锁DEGs也富集在KS FGCs发育过程最重要的通路中，如早期FGCs的组蛋白修饰、翻译起始、经典WNT通路和去甲基化通路（图4i做），以及KS晚期FGCs的细胞周期和ATP合成偶联电子传递通路（图4i右）。值得注意的是，X连锁癌症/睾丸抗原基因 （CTX 基因） 对晚期FGC的发生至关重要，但 CTX 基因（如 MAGEA3、SAGE1、TFDP3、GAGE1、PAGE1 和 GAGE2A）的表达水平在KS的早期FGCs到晚期FGCs显著低于男性对照组（图4j）。上述结果表明，上调的X连锁基因可以通过直接扰乱关键的生物途径来损害 KS FGCs的正常发育。

图4 KS FGCs中X染色体的状态和转录特征

4. KS患者FGC中的表观遗传改变

       由于FGC经历广泛的DNA甲基化擦除，正确的DNA甲基化对于FGCs的发育非常重要。研究人员进行了单细胞三组学测序 （scTrio-seq） ，以表征性腺细胞的 DNA 甲基化图谱，KS胎儿早期FGCs整体甲基化水平为5.33%，低于男性对照的7.06%和女性对照有丝分裂时期FGC的8.08%；KS胎儿晚期FGCs整体DNA 甲基化水平6.73%， 升高到与男性对照（6.45%）相当的水平，但仍低于女性FGCs减数分裂期的水平（8.52%）（图5a）。先前的研究表明，在FGCs中大多数印记基因控制区（ICR）会与全基因组DNA一起去甲基化，但是IGF2R 和PEG10的ICR可以逃避完全擦除。与男性对照相比，这些ICR在KS早期FGCs中甲基化水平更低（图5b-c），表明KS早期FGCs经历了更彻底的印记擦除。

       研究人员分别比较了常染色体、X染色体和Y染色体的DNA甲基化程度，发现FS胎儿性腺的常染色体和Y染色体甲基化模式与男性对照无明显差异，但是KS胎儿FGC中的X染色体DNA甲基化程度低于男性对照，而KS胎儿性腺体细胞中X染色体DNA甲基化程度高于男性对照（图5d）。以上结果表明，KS中的DNA低甲基化是FGCs特异性的，且主要集中于X染色体上。

       进一步对DEGs 和差异甲基化启动子（DMP）联合分析，发现二者的重合十分有限（图5f），证明除了部分参与生殖细胞发育和有性生殖的基因，大多数基因的表达与启动子甲基化水平无关。然而，研究人员仍然发现在KS晚期FGCs中，TFDP3和SAGE1等CTX基因在其启动子处的甲基化水平显著升高，这可能导致其表达较低（图5f），证实KS中异常的DNA 甲基化可能会损害FGC的分化。

       研究人员对各种基因组元件甲基化水平的分析表明，大部分元件在KS早期FGC中均表现出较低的甲基化，而在晚期FGC和性腺体细胞中未观察到这种较低的甲基化。值得关注的是，KS FGC中较高的甲基化区域主要富集在SINE-VNTR-Alus （SVA）中（图5g），它们在KS中被称为去甲基化逃逸SVA。先前的研究表明，在生殖细胞中未经历完全重编程的特定DNA甲基化区域，是跨代表观遗传的候选者[5]。研究者发现在KS中鉴定的去甲基化逃逸 SVA 亚群，在正常精子和早期胚胎中也呈现类似的甲基化模式，这意味着这些 SVA 可能参与KS的跨代表观遗传遗传。

图5 KS FGC的表观遗传改变

5. 性腺体细胞的转录失调影响生殖细胞迁移

       性腺发育是生殖细胞和性腺体细胞高度协调的过程，性腺体细胞发挥了重要功能。研究人员用10X Genomics scRNA-seq描绘了性腺体细胞的转录特征及其与 FGC 的相互作用；对KS 胎儿和男性对照胎儿性腺进行空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq），评估了性腺细胞的空间分布和相互作用模式。

       根据10X Genomics的数据，他们在胎儿性腺中鉴定出14 个细胞类群，KS 胎儿和男性对照胎儿的性腺的细胞组成非常相似（图6a）。支持细胞与生殖细胞直接接触，且成年KS患者性腺细胞中支持细胞转录组改变是最大的[6]，因此研究人员主要关注了支持细胞的发育及其与 FGC 的相互作用。在 Sertoli谱系中鉴定了三个细胞亚群：支持细胞祖细胞（SPC），支持细胞1（SC1）和支持细胞2（SC2）（高度表达腺体发育、细胞-底物粘附和细胞迁移相关的基因），SPC，SC1和SC2在发育程度上逐渐成熟。与雄性对照相比，KS胎儿的所有支持细胞亚群在支持细胞发育、细胞迁移、细胞粘附和微管细胞骨架组织方面都表现出较低的分数（图6b），表明KS的支持细胞系存在缺陷，迁移和运动功能受损。

       研究人员使用CellChat分析性腺细胞之间的相互作用，分析了KS胎儿中受损的迁移相关的细胞间通讯（SEMA7 信号转导通路）。SEMA7A-ITGB1 信号传导主要源自支持细胞到包括FGC在内的各种其他细胞，在KS中，支持细胞和FGC之间的SEMA7A-ITGB1相互作用减少（图6c-d）。免疫荧光进一步显示在雄性对照睾丸索与 SEMA7A 支持细胞紧密相邻的 ITGB1 细胞中，而在 KS 组ITGB1信号显著减弱（图6e）。

       已知人类胎儿性腺中的支持细胞和晚期FGC在受精后18 周开始从中心迁移到睾丸索的基底膜处[7]。为了研究KS胎儿性腺中细胞的迁移障碍，研究人员进行了Stereo-seq，结果显示男性对照中的晚期FGC倾向于分布在睾丸索的基底部，而KS胎儿的晚期FGC倾向于分布于中心（图6f）。为了证实上述测序分析结果，他们进行了SOX9和DDX4共染，结果发现KS组支持细胞核厚度增加，晚期FGC的基底部分布比例降低（图6g-i），证实 了KS性腺中支持细胞和FGC向基底膜的迁移受损。

图6 性腺体细胞的转录特征及其与 FGC 的相互作用

6. TGF-β抑制剂促进KS FGC分化

       为了进一步探索KS FGC的分化能力和潜在的治疗干预措施，研究人员使用体外性腺培养系统进行体外相关研究结果发现，在体外培养35天后，男性对照胎儿性腺的DDX4（晚期FGCs）/TFAP2C（早期FGCs）比值值显著增加，表明正常胎儿性腺在体外进行了有效分化；然而在KS胎儿性腺中未观察到这种分化（图7a-b）。当用TGF-β抑制剂SB431542处理之后，4个KS患者胎儿性腺中的3个DDX4/TFAP2C 比值出现显著增加，其余1个没有显著增加（图7c）。由此，研究人员推断KS FGCs的具备较差分化能力，而抑制TGF-β可以改善 KS FGCs的分化能力。

图7 TGF-β 抑制剂促进 KS FGC 分化

       该研究首次描述了KS胎儿性腺细胞的发育障碍、转录特征和DNA甲基化改变，揭示了KS胎儿FGC中额外X染色体未发生失活，导致X连锁基因表达上调，影响了WNT通路和TGF-β通路等FGC发育的关键通路，使得FGC的发育分化能力受损，从而停留在早期阶段。此外，研究发现KS胎儿性腺中支持细胞迁移等通路相关基因表达下调，与FGC的迁移相关信号通讯减弱，导致FGC向睾丸索基底部的迁移减少。该研究不仅揭示了额外的X染色体损害男性FGC发育的机制，还发现TGF-β通路抑制剂可以显著改善KS患者FGC的发育障碍。然而，KS患者FGC发育过程中异常的DNA甲基化在KS的发病和遗传过程中发挥何样的作用尚有待探索。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-024-08104-6

小编：张杲琛