Science丨Nr5a2对合子基因组激活是非必要的但对于桑葚胚的发育是必不可少的

NR5A2控制着床前胚胎发育

早期胚胎发生由转录因子驱动，转录因子首先激活合子基因组，进而调控囊胚谱系。谱系决定始于8细胞桑葚胚，并依赖于合子基因组激活（zygotic genome activation, ZGA）。虽然指定各个谱系的转录因子（transcription factors, TFs）网络已被表征，但卵裂球是如何通过ZGA进展并启动这些早期基因调控程序目前尚不清楚。2024年10月4日，法国巴斯德研究所表观基因组学单元的研究人员在Science杂志上发表了题为Nr5a2 is dispensable for zygotic genome activationbut essential for morula development的文章，发现孤儿蛋白受体NR5A2在合子激活到桑葚胚这个发育阶段发挥关键作用。

在哺乳动物中，着床前胚胎发育涵盖了从受精卵到复杂结构（囊胚）的转变，囊胚由3个谱系构成，并产生所有胚外组织和胚胎组织。胚泡谱系的确定始于桑葚胚，桑葚胚由16-32个细胞组成，由合子的连续分裂和压实产生，通过几种转录因子（transcription factors, TFs）分级作用介导完成，包括：TEAD4，GATA3和CDX2负责胚胎外滋养外胚层（extraembryonic trophectoderm, TE）分化；SOX2和OCT4等支持内细胞团（inner cell mass, ICM）的形成，促成早期胚胎形成；NANOG和GATA6促进胚胎多能外胚层（embryonic pluripotent epiblast, EPI）形成，并由胚胎外原始内胚层（extraembryonic primitive endoderm, PrE）形成具有着床和进一步发育能力的晚期囊胚[1]。调控囊胚形成的大量转录因子功能已基本明确，但何种转录因子保证了正常桑葚胚形成目前仍不清楚。

转录因子还与小鼠发育开始的第一个调控步骤——合子基因组激活（zygotic genome activation, ZGA）有关，ZGA在两细胞（2 Cell, 2C）阶段启动转录[2]。与谱系决定不同，许多在囊胚形成中起着重要作用的转录因子，诸如DUX, RARG, DPPA2/4, NFYA等，在ZGA阶段虽被干扰，通常不会损害ZGA或两细胞阶段的进展[3,4]。最近有两类转录因子被提出在ZGA过程中发挥优势作用：OBOX和孤儿核受体NR5A2[5,6]。但NR5A2的作用仍存在争议。在NR5A2的化学抑制下，培养胚胎的发育早在2C阶段就发生了阻滞，这种表型在很大程度上与受损的ZGA有关[6]。而使用碱基编辑技术的研究则表明，NR5A2在后期发挥主要作用，控制谱系决定因子的转录[7,8]。这些相互矛盾的研究指出NR5A2作为早期胚胎发生调节剂的重要性，但目前尚缺乏来源Nr5a2稳定敲除模型的结论。因此，在NR5A2缺乏的情况下，胚胎是否可以在宫内正常发育，且观察到的相关发育表型是否由NR5A2作为ZGA的启动者介导的，还是在其合子表达后期通过基因调控介导的，这些问题仍存在不确定性。考虑到雌激素相关受体b（estrogen-related receptor b, ESRRB）等在维持小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）多能性基因调控网络活性方面的冗余，这使得明确NR5A2的关键功能变得更加复杂[9,10]。因此，在本文中，研究人员建立了稳定可诱导的KO小鼠模型，以确定胚胎植入前NR5A2的作用，并研究其与ESRRB的潜在功能互作。

1.母源表达的NR5A2和ESRRB在胚胎发生中是非必要的

为研究NR5A2和ESRRB在着床前发育中的作用，研究人员繁育了Esrrb和/或Nr5a2条件敲除的雌性小鼠，并结合Zp3:cre。这一研究策略可用于Nr5a2（NrKO）和Esrrb（EKO）及两者（oKO/DKO）母源缺乏（maternal, mKO），合子缺乏（zygotic, zKO），或母源-合子缺乏（maternal and zygotic, mzKO）的胚胎表型研究。研究人员首先对母源Nr5a2和Esrrb缺失的影响进行了研究。结果发现，卵母细胞缺乏NR5A2, ESRRB或两者的雌性产下的幼崽与匹配对照的幼崽大小无显著差异（图1A），有效地传递了缺失的等位基因。排除了NR5A2或ESRRB在母源遗传中的决定性作用。通过观察oKO卵母细胞或mzKO胚胎，在ZGA之前（GV oocyte）或前后（2C）研究者没有发现NR5A2的表达（图1B），而在之后的4细胞（4 Cell, 4C），8/16细胞阶段（8/16C）的桑葚胚时期，NR5A2的表达可以被观察到。同样，对Esrrb-TdTomato报告小鼠的卵母细胞和胚胎进行观察，发现ESRRB很大程度上不是母源遗传的，仅在2C晚期阶段才可被检测到（图1C）。以上结果表明，NR5A2和ESRRB并不是关键的ZGA母源调控因子。

图1. 着床前发育不需要母源NR5A2和ESRRB

2.NR5A2在ZGA期间发挥非必要作用

Nr5a2 mKO在2C阶段的正常发育与最近NR5A2作为关键的ZGA调控因子的提议产生了矛盾[6]。为了进一步评估NR5A2在ZGA过程中的潜在作用，研究人员对102个对照和Nr5a2 oKO的卵母细胞以及mKO，zKO及mzKO的早期2C（E2C）进行了全长单细胞RNA测序（FLASH-seq）。同时，还在ZGA之后晚期2C（L2C）、早期4C和8C阶段分析了122个对照，NrKO，EKO或oKO的mzKO胚胎。结果显示，Nr5a2缺失的生长中卵母细胞在受精前的基因表达差异极小（图2A和2B），说明KO胚胎和对照胚胎的发育起点几乎相同。少量基因在ZGA前后受到影响：即在mzNrKO胚胎中，差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）在E2C阶段也很少。相似地，在L2C阶段，mzDKO和mzNrKO胚胎也表现出有限的基因表达差异（图2A和2B）。随后，基因表达差异逐渐增大，特别是在8C阶段，有超过2000个基因表达受到mzNrKO的影响（图2A和2B）。此外，从L2C阶段开始，当一组不同的基因开始在mzNrKO或mzDKO中差异表达时，原本E2C胚胎依赖于NR5A2的基因表达在KO组中不受影响（图2B和2C）。这表明NR5A2和ESRRB的两种非重叠功能之间的急剧转变，可能取决于ZGA前后胚胎的不同转录景观。

随后研究人员评估了ZGA过程中，NR5A2缺失对被激活的2107个基因表达的影响[6]，结果并没有观察到它们在卵母细胞到8C胚胎表达谱的全局变化，说明在所有突变体中ZGA程序基本正确，NR5A2和ESRRB在这一阶段并未发挥关键作用（图2D）。在E2C胚胎中，母源Nr5a2的完全缺失（mNrKO）仅破坏了11个基因的激活（图2E左）。在进一步合子Nr5a2缺失（mzNrKO）之后也仅有5%的ZGA基因表达异常（图2E中）。在L2C阶段，当ZGA基本完成时，Nr5a2和Esrrb的mzDKO仅影响71个基因的表达（图2E右）。类似改变在Nr5a2 mzKO和zKO中被发现，提示合子表达的NR5A2是这些基因改变的主要因素。此外，在2C胚胎中，应答基因在NR5A2结合区域附近表现出弱富集（图2F），提示间接调控的可能性。以上结果说明，母源与合子Nr5a2表达有助于调控一小部分ZGA基因。

除单拷贝基因外，ZGA还具有几个重复元件的转录特征（MERVLs, MaLRs , SINE B1/Alu 等元件），以促进附近基因的表达（SINEs, short interspersed nuclear elements）。研究者发现，尽管NR5A2和SINE有部分结合，但与其他两者的关系不甚显著，在L2C胚胎中仅有MERVL有轻微下调趋势（图2G），进一步证实Nr5a2的功能在ZGA阶段是可有可无的。此外，仅有少数E2C阶段的特定调控因子基因，如Zscan4和Tscstv出现在该阶段的DEGs中。

随后，研究人员分析了高度表达于E2C阶段的358个基因，分别有10个和66个基因在Nr5a2 mKO和mzKO中下调（图2H）。尽管如此，这些基因并没有富集于NR5A2作用的区域附近（图2I）。这表明NR5A2介导一小部分的E2C特异性基因的激活。研究人员又检查了已知的ZGA调控因子，Obox和Dux是否受到NR5A2的影响，但是这些基因的表达没有增加，排除了它们可能在功能上代偿性弥补NR5A2缺失。此外，研究团队也并未发现受Nr5a2和Esrrb mzKO影响的基因与Dux mzKO在2C时期之间存在交集。然而，根据OBOX对Nr5a2的激活效应，在Obox mzKO中存在到部分交集基因，提示NR5A2可能在于这些基因的下游发挥作用。

综上，合子和母源表达的NR5A2在合子转录开始后参与基因表达调控，然而，NR5A2并不是ZGA的必要调控因子。NR5A2仅支持一小部分ZGA和E2C特异性基因的激活，这些作用是短暂的，可能是间接的，并依赖于其合子和母源的联合表达。L2C阶段，ZGA在所有突变体胚胎中都已基本完成，NR5A2表达增加，开始与ESRRB调控一组独特的基因。

图2. 在NR5A2完全缺失的情况下，ZGA继续进行仅轻微缺陷

3.合子表达的NR5A2对桑葚胚的发育至关重要

鉴于在8C阶段出现了广泛的转录失调（前述超过2000个以上DEGs），研究团队试图评估Nr5a2和Esrrb母源及合子缺失对ZGA之后胚胎发育的影响。已知Esrrb的遗传缺失仅在着床后才会引起胚外谱系的发育缺陷[11]。与此一致的是，Esrrb mzKO不影响着床前发育：在胚胎发育的第4.25天（E4.25），可以从形态正常的突变囊胚中分离出已经完成谱系分化的细胞（图3A和3C）。但所有E3.5-E4.25 Nr5a2 mzKO的胚胎则表现出严重的形态异常和显著的发育迟缓（图3B和3C），伴随细胞数量减少，细胞核形态退化，以及细胞分裂的无序进展（图3D）。为排除遗传背景造成的潜在偏差（C57BL/6），研究团队又在CD-1和C57BL/6混合背景进行了验证，得到了同样结果。因此推断，合子中Nr5a2的表达可能发挥了主导作用。为了确认NR5A2在4C期后的功能，及排除任何早期作用的影响，研究团队采取了两种互补策略：i）在mzKO出现形态学缺陷之前诱导Nr5a2的缺失；ii）从4C期挽救NR5A2缺陷。对于第一种方法，研究人员使用了他莫昔芬诱导的ROSA^Cre-ERt2驱动。结果显示，在ZGA完成后，mzKO突变体中观察到的表型异常是通过触发Nr5a2的丢失来重现的。相反，在ZGA之后的4C期，注射体外转录的Nr5a2 mRNA可挽救mzNr5a2KO胚胎的幼鼠致死率和发育迟缓（图3E）。以上结果排除了母源Nr5a2表达对于ZGA期间的重要作用，进一步确定突变体胚胎的发育失败是由于合子NR5A2的丢失。

为了确定突变体中首要缺陷出现的时间，研究团队培养了在4C期分离的Nr5a2 mzKO胚胎。实时成像显示发育迟缓和缺陷在8C期后逐渐发生，到对照胚胎形成胚泡时，突变体的桑葚胚完全退化。在宫内E2.75（8C-16C），Nr5a2 mzKO和DKO的mzKO胚胎中，NANOG和GATA3在部分胚胎细胞中的表达受到抑制，但是大多数细胞继续表达GATA6（图3F）。在E2.5时，突变体已表现出发育迟缓（图3C），以及早期NANOG表达消失。上述结果提示合子NR5A2在第一谱系分离和桑葚胚形成过程中的关键性作用。

图3. NR5A2是正常桑葚胚发育所必需的

4.NR5A2在调控谱系决定-细胞分裂-基因组稳定性方面占主导地位

鉴于在8C阶段观察到的严重表型，研究团队进一步探讨了母源和合子Nr5a2和Esrrb缺失对ZGA之后胚胎发育的影响。如前所述，与突变胚胎明显缺陷的一致，基因失调从L2C到8C逐步增加。2C和4C阶段的基因表达趋势基本一致，突变胚胎中缺失表达的DEG之间的重叠更强。在4C阶段受影响的基因在8C阶段也表现出一致性的变化，但基因调控的整体相似性不太明显。Esrrb mzKO对8C期有轻微的影响，而Nr5a2 mzKO再现了双重Esrrb和Nr5a2 mzKO的效果（图4A，4B和4C）。通过对这些影响的可视化分析，发现Nr5a2 mzKO和mzDKO胚胎仅在4C阶段开始与野生型和Esrrb mzKO胚胎分离，并在8C阶段与对照几乎完全分离（图4D）。

为表征NR5A2在L2C到8C阶段所调控的基因，研究团队在实验条件下结合所有DEGs进行了基因本体（GO）分析（图4E）。发现如“囊胚”和“胎盘发育”等发育术语是最为富集的，包含了EPI（Nanog, Klf4, Sox15）和TE（Tead4, Tfap2c, Gata3, Klf5, Cdx2）谱系决定的关键效应基因。这些基因主要在Nr5a2 mzKO和mzDKO胚胎中8C期下调（图4F）。因此，提示NR5A2参与控制囊胚形成关键转录因子的表达调控。另一组关键GO术语与有丝分裂和细胞分裂缺陷有关（图4E），包括对着丝粒有丝分裂调控重要的基因（Cenpa, Haspin, Borealin, Shugosin）或细胞周期调节因子，这组基因主要在2C或4C阶段下调（图4F）。最后是一组关键GO术语与DNA修复，同源重组和端粒维持相关的基因相关（图4E），其中包括端粒蛋白和参与DNA复制和修复的基因，它们在端粒的维持中起着核心作用。

图4. 转录组在Nr5a2 KO胚胎中逐渐失调

5.NR5A2保证其调控基因集的染色质可及性

接下来，研究团队进一步探究了NR5A2与这些差异基因之间的转录调控关系。利用NR5A2缺失模型，他们通过转座酶可及染色质测序测定（assay for transposase-accessible chromatin sequencing, ATAC-seq）测量了染色质可及性的变化。研究团队不仅分析了E2C阶段（合子NR5A2首次表达时期）诱导NR5A2功能丧失的胚胎，还对8C胚胎中由NR5A2结合的16958个基因组区域进行了分析，结果发现NR5A2以相似的比例结合在可及区和低或不可及区（图5A）。尽管作用于低可及性区域符合先锋转录因子的活性，但NR5A2的这种结合并不一定是可及性变化的直接原因。为了确定这两类结合位点之间的潜在差异，他们分析了这些位点的DNA序列。结果发现，NR5A2基序在绝大多数结合区域富集，表明招募是直接与DNA结合驱动的。被OBOX因子靶向的同源盒基序也存在于NR5A2占据的区域。与此一致的是，与NR5A2和OBOX结合相关的重复元件在NR5A2结合区域显示出有限的差异富集。SINE元件在非可及性染色质中富集，而ERVLs则集中于可及区（图5A）。其他早期胚胎发生中起关键作用的转录因子，KLF和TFAP2c，集中于NR5A2位点附近最易接近的区域（图5A）。以上表明NR5A2可以单独结合DNA发挥作用，也可以与特定类型的发育因子互作，调控染色质可及性。Nr5a2 mzKO可导致近一半ATAC信号靶点的减少，但仅有8%的靶点显示可及性增加。除此之外，mzKO中ATAC信号升高的位点变化不大，提示NR5A2间接影响其他区域的可能性。因此，NR5A2可能主要通过增加其靶点处的染色体可及性。

6.NR5A2通过不同机制调控基因

最后，研究团队试图将染色质可及性的变化与基因调控联系起来。通过分析发现，由NR5A2激活的基因近端区域（上下游50 kb）在KO胚胎中更易丢失染色质可及性（图5B）。同样NR5A2调控基因在NR5A2结合区和可及性附近富集。在KO胚胎中，由NR5A2激活的基因表现出附近区可及性的显著丢失（图5C），而NR5A2抑制的基因则表现出相反的模式。其中与ICM或TE相关的基因、及参与有丝分裂的管家基因等，NR5A2的这种直接调控迹象在整体范围内都是显著的（图5D）。与那些非NR5A2调控区域等区域相比，上述与ICM或TE相关的及参与有丝分裂的基因类目中接近NR5A2阳性靶向区域者在Nr5a2 KO后显示出更为显著的染色体可及性降低（图5D）。然而，研究显示NR5A2未必需要在结合位点建立可及性来调控基因表达，因为其结合但不可及的区域在也存在调节基因的富集（补图5D）。因此，NR5A2似乎可以直接激活对胚胎发育和谱系决定关键基因的表达，如Tead4（图5E，以Tead4的激活模式为例）。他们还观察到，在8C阶段，NR5A2调控的基因产生起源于ERVL元件的嵌合转录物（图5F）。这些与阳性靶标相连的ERVL元件通常紧邻NR5A2结合的SINE重复序列。结合他们之前的分析，这表明与SINE元件的结合使NR5A2的基因调控远远超过2C阶段，并揭示SINE和ERVL重复序列在基因表达调控中真实的合作关系。综上，他们的研究确定NR5A2是一个重要的发育调控因子，在连接ZGA到谱系决定的初始阶段直接调控基因表达。

图5. NR5A2促进了附近调控区域的染色质可及性

该项研究使用Nr5a2缺失的小鼠模型，发现Nr5a2^-/-胚胎在桑葚胚早期阶段停滞，表现出谱系分化的受损、频繁的有丝分裂失败和大量染色体分离缺陷。尽管NR5A2在合子基因组激活过程中可能发挥一定的作用，但本项研究首次证实它在8细胞阶段发挥主要调控作用，控制谱系特异性转录因子表达，参与有丝分裂、端粒维持和DNA修复基因的表达，并通过调节染色质可及性发挥关键作用。该研究阐释了Nr5a2通过协调增殖、基因组稳定性和谱系特异性等途径，在桑葚胚发育过程中发挥重要作用。在早期胚胎发育的研究中，一些关键基因在调控时相上的差异，NR5A2分别在ZGA时期和8C期的作用强弱形成了强烈的反差。值得关注的是，本研究中NR5A2的功能妥善衔接了从ZGA结束到谱系决定阶段关键基因的表达调控机制，填补了这一阶段的研究不足，并对早期胚胎发育这一重大科学问题提供了新见解。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adg7325?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed    

小编：莫佳航

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