Nature：母体缺铁导致小鼠胚胎中雄性与雌性发生性别逆转

在哺乳动物的性别决定过程中，由于睾丸决定基因Sry的表达，两性性腺分化为睾丸[1,2]。在小鼠中，Sry的表达受到严格调控[3]，它仅在性腺体细胞的一个亚群中被激活，该亚群被称为前Sertoli 细胞，且仅在胚胎第10.5天至第12.5天被激活。染色质中DNA和/或组蛋白的甲基化会影响关键发育基因的转录，此前研究表明，JmjC 家族的H3K9去甲基化酶KDM3A主要在发育中的性腺前Sertoli细胞中表达[4]，它通过去甲基化Sry基因座上的H3K9me2（转录抑制异染色质的标志）来激活Sry。铁不仅在氧的运输中，而且在细胞内一系列广泛的氧化和还原酶促反应中都发挥着不可或缺的作用。JmjC家族组蛋白去甲基化酶的酶活性需要易溶的 Fe²⁺。机体中铁的新陈代谢受到细胞结合、利用、储存和排泄机制的严格调控[5]；然而，在发育和生理过程中，铁的新陈代谢与组蛋白去甲基化发生交叉作用的程度和性质在很大程度上是未知的。本研究发现铁代谢在 KDM3A 介导的小鼠雄性性别决定中起着至关重要的作用，揭示了哺乳动物新陈代谢与雄性性别决定之间意想不到的联系。

1.Fe²⁺在前Sertoli细胞中正向累积

研究者在性别决定期（E11.5）从性腺和肾系膜分离出NR5A1+性腺体细胞和 NR5A1-肾系膜及生殖细胞。mRNA定量表达分析证实，NR5A1+部分包括Sry表达（前Sertoli）细胞，但NR5A1-部分不包括。Kdm3a在NR5A1+细胞中的表达量高于NR5A1-细胞。铁结合基因Tfrc和Scara5以及Fe²⁺生成基因Slc11a2、Steap3、Ncoa4和Hmox1在NR5A1+细胞中的表达量高于NR5A1-细胞，但铁排泄基因Slc40a1和Heph的表达量则相反，线粒体Fe²⁺结合基因Slc25A37在NR5A1+细胞中的含量低于NR5A1-细胞。基因表达分析表明，在负责性腺性别决定的细胞中，Fe²⁺在其细胞质和细胞核中显著累积。        

研究者用免疫荧光法检测了完整的E11.5 XY性腺中铁代谢蛋白的表达。NR5A1和 GATA4蛋白被用作性腺体细胞的标记。与其他组织相比，性腺中铁结合的TFR1和 SCARA5以及产生Fe²⁺的NCOA4和HO1的检测率更高，但肝脏除外，因为肝脏是储存铁的主要器官。研究者们还通过免疫印迹检测了这些蛋白质的组织分布。这些数据表明，基因和蛋白质表达谱有利于Fe²⁺在负责性别决定的性腺细胞中积累。

图1：在雄性性别决定过程中，铁代谢途径在胚胎性腺中被独特地激活

2.TFR1增强Sry的H3K9去甲基化

研究者建立了缺乏铁代谢基因的小鼠以评估铁代谢对Sry表观遗传调控的潜在贡献。Tfrc（TFR1）通过内化转铁蛋白-铁复合物在细胞铁结合中起着关键作用，但由于Tfrc的全基因无效突变会导致性别决定前的胚胎死亡，因此研究者在性别决定前选择性地破坏性腺体细胞中的 Tfrc，在Tfrc第3外显子周围插入loxP序列，建立了 Tfrc的条件突变等位基因（Tfrc2l）。研究者将这些小鼠与Wt1creERT2小鼠交配，给携带Wt1creERT2;Tfrc1l/2l小鼠的母鼠在E8.5出生时注射4-OHT，并证实在E10.8 出生时这些胚胎的性腺体细胞中特异性地删除TFR1。

免疫荧光分析表明，XY Tfrc1l/2l-cKO 性腺中SRY的平均表达量约为XY对照性腺在 E11.5 阶段的 50%。并且在E11.5 XY Tfrc1l/2l-cKO NR5A1+ 细胞中，Sry启动子的 H3K9me2 水平比对照NR5A1+细胞高出近两倍，这表明Sry基因座的H3K9去甲基化失败。此外研究者检测了Tfrc1l/2l-cKO小鼠青春期或成年期的内外生殖器。值得注意的是，39只XY Tfrc1l/2l-cKO小鼠中，有6只小鼠表现出雄雌性别反转，呈现有两个卵巢，还有一只小鼠部分雌性化，表现为有一个卵巢和一个睾丸。相比之下，所有XX Tfrc1l/2l-cKO青春期小鼠似乎都发育成了正常雌性。该部分研究结果表明，胚胎性腺体细胞中正确的铁平衡是体内正常雄性性别决定所必需的，并表明TFR1介导的铁结合途径与KDM3A介导的Sry表观遗传调控有关。

图2：TFR1 介导的铁结合可增强 Sry 的 H3K9 去甲基化

3.低铁水平影响体外性腺中 Sry 的激活

研究者开发了一种体外性腺培养系统，从E10.8胚胎中分离出主动脉、性腺、肾间质和间充质用不同的培养基在膜上培养，以进一步阐明缺铁对性腺性别决定的影响机制。使用标准培养基，XY样本中Sry的表达在培养19.2小时后达到峰值，其表达水平与 E11.5子宫内性腺的表达水平相当。在XY或XX样本中，再培养24小时就会产生性分化的性腺，其中有SOX9+雄性型体细胞或FOXL2+雌性型体细胞。在预分化过程中向培养基中添加了铁特异性螯合剂去铁胺（DFO）。经DFO处理的性腺与未处理的性腺中 NR5A1+ 细胞的数量没有区别，表明 DFO 处理不会影响性腺体细胞的生长潜力。通过ICP-MS直接铁测量显示，DFO处理后，NR5A1+细胞中的铁含量降低了约40%。而用DFO处理会导致NR5A1+细胞中储存铁的H-ferritin和L-ferritin 水平显著降低，约为未经处理的NR5A1+细胞的五分之一。这些数据证实，DFO 处理大大降低了细胞的铁含量。

在未经处理的 XY 性腺中，FOXL2+细胞的比例为0%，但在经DFO处理的XY性腺中，这一比例达到了近90%。DFO处理并不影响XX性腺的雌型性别分化。在实验中引入了携带Hsp-Sry转基因的突变小鼠品系，以强制表达Sry；这恢复了雄性型性别分化，表明缺乏内源性Sry表达是DFO处理后性腺中雄雌性别逆转的原因。当添加足够的铁与DFO处理同时进行时，雄性性腺性别分化完全恢复，进一步表明DFO处理引起的性别逆转是由于缺铁造成的。

研究者分离经DFO处理的NR5A1+细胞并进行了mRNA-seq分析，结果表明DFO处理直接作用于Sry表达相关的雄性性腺性别决定基因网络，表现出与KDM3A在这些基因网络中的作用一致。包括Sry在内的大约40%的KDM3A靶基因被DFO处理下调。包括 Kdm3a在内的一系列需要铁的表观遗传修饰基因的表达也受到 DFO 处理的上调，表明这些酶的基因表达可能受到铁水平的反馈调控。

在对照培养基中培养时，性腺体细胞中的H3K9me2水平明显低于中肾细胞，然而用DFO培养时，性腺体细胞中的H3K9me2水平上升到与中肾细胞相当的水平。ChIP-qPCR 分析表明，在DFO处理的NR5A1+细胞中，Sry启动子上的H3K9me2水平也几乎是未处理的NR5A1+细胞的两倍。经 DFO处理的XY性腺中SRY的平均表达量约为未经处理的XY性腺的30%。而当用DFO培养XY Ehmt1Δ/+性腺时，SRY表达量恢复到未处理对照组的近50%。RK-701是EHMT1-EHMT2 复合物的化学抑制剂，在DFO处理过程中加入RK-701后，SRY的表达恢复到未处理对照组的近70%。ChIP-qPCR分析表明，通过引入 Ehmt1杂合突变和添加 RK-701还能恢复Sry启动子的 H3K9me2水平。这些结果共同证实，缺铁诱导的Sry抑制是由于Sry基因座缺乏H3K9去甲基化所致。由于除Kdm3a之外的JmjC家族H3K9去甲基化酶也在NR5A1+细胞中表达，因此抑制它们的酶活性可能会增加DFO处理导致的H3K9me2水平的增加。

图3：缺铁可抑制培养性腺中 Sry 的激活

4.母体缺铁导致胎儿性别逆转

接下来，研究者们测试了母体缺铁是否会影响子宫内胚胎的性别发育，在胚胎性别鉴定前后通过药物诱导母体缺铁，然后检测子宫内发育胚胎的性别发育。经 DFX处理的母体所怀的E11.5胚胎表现出典型的贫血症，其NR5A1+细胞中的H-和L-铁蛋白水平明显下降。在72只由DFX处理的母亲所生的XY小鼠中，4只具有两个卵巢，1只具有一个卵巢和一个睾丸，这表明在性别决定期前后母体急性缺铁会导致一部分野生型后代出现雄性变雌性的性别逆转。由于经 DFX 处理的母亲和对照组母亲所怀的XY胚胎在 E11.5 性腺中的 NR5A1+ 细胞数量没有区别，暗示DFX不会影响胚胎性腺体细胞的生长潜力。另一方面，在经 DFX 处理的母亲所怀胚胎的XY性腺中，SRY的表达量大幅下降，仅为对照组XY性腺的近60%。在经DFX处理的母亲携带的胚胎的XY性腺中，NR5A1+细胞中的Sry mRNA表达量减少到对照组NR5A1+细胞的近40%。这些数据表明母体缺铁从本质上影响了子宫内发育胚胎中Sry的激活，且至少部分是通过抑制KDM3A的活性。此外，他们还发现DFX处理的母体所怀胚胎的E13.5 XY性腺具有典型的睾丸，其中同时含有FOXL2+细胞和SOX9+细胞，FOXL2+细胞的比例达到约20%。通过强制表达Hsp-Sry转基因恢复SRY的功能，可有效地降低DFX处理过的母亲所怀胚胎XY性腺中FOXL2+细胞的比例，使其接近 XY 对照性腺中的比例，这表明 DFX 处理过的母亲所怀胚胎的XY 性腺的睾丸表型是由于 Sry（SRY）的表达减少所致。

图4：药物诱导的母体缺铁会导致子宫内发育胚胎的雌雄性别逆转

研究者们为评估母鼠饮食中铁摄入量的减少是否会影响发育中胚胎的性别发育，对雌性小鼠喂食缺铁饮食（IDD）六周，包括怀孕前四周。在母鼠体内，通过检测，他们发现IDD会逐渐降低血红蛋白水平和红细胞数量，当相应的胚胎发育到性别决定阶段E11.5时，就会出现贫血。IDD性腺中E11.5 NR5A1+ 细胞的铁含量约为CD性腺的60%。蛋白质表达分析证实了胎儿表现为缺铁。同样，IDD性腺和CD性腺中NR5A1+细胞的数量也没有区别。在XY Kdm3a+/+ IDD性腺中，SRY的表达量减少至XY Kdm3a+/+ CD性腺的近70%。在E11.5 XY Kdm3aΔ/+ 性腺中，SRY的表达进一步降低，仅为XY Kdm3a+/+ CD性腺的近50%。在不同基因型和饮食条件的XY发育性腺中，Kdm3aΔ/+ IDD性腺的性腺H3K9me2水平最高，其次是Kdm3a+/+ IDD性腺，然后是Kdm3a+/+ CD性腺，这支持母体饮食缺铁的作用点是KDM3A介导的Sry激活这一观点。

图5：饮食诱导的母体缺铁会损害子宫内发育胚胎的雄性性别决定途径

本研究表明在性别决定过程中，铁结合途径和Fe²⁺生成途径在发育的性腺中同时被激活，从而促进了KDM3A介导的Sry基因座上的H3K9去甲基化。由于Sry的这种表观遗传调控机制高度依赖于细胞内的Fe²⁺水平，因此母体缺铁会直接导致一些子宫内发育中的胚胎出现雌雄性别逆转现象。但未来的研究仍有亟待解决的问题：比如如在性腺性别决定以外的发育过程中，缺铁如何通过改变组蛋白和DNA甲基化状态，从而改变基因表达谱可能也是未来需要关注的方向。在全球范围内，孕妇缺铁性贫血是一个普遍存在的问题，据估计，35.5% 的孕妇会在怀孕期间缺铁，而研究结果确定了铁在哺乳动物性别决定中的作用，并强调了孕妇（尤其是可能缺铁的孕妇）保持足够的铁水平以确保胎儿性别分化正常的潜在重要性。该发现不仅为胚胎性别决定的研究提供了新的视角，也为孕妇的营养管理提供了重要的科学依据。

图6：全文总结图示

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09063-2